动脉硬化检测仪

动脉粥样硬化是指动脉血管内膜脂质等成分沉积、平滑肌细胞增生和胶原纤维增多，形成粥糜样含脂坏死病灶和血管壁硬化。如何预防或改善呢?

　　细胞内一氧化氮合酶NOS能够生成一氧化氮NO，可以调节血管内皮张力，抑制平滑肌细胞的有丝分裂，抑制血小板粘附和聚集，能够起到保护血管的作用。该论文通过细胞体外模型实验研究，观察探讨茶色素对内皮细胞一氧化氮合酶生成的影响。动脉硬化测定仪校准模块

　　一、方法

　　利用人脐静脉内皮细胞的培养、鉴定及细胞毒性实验：参照培养内皮细胞的方法，用胰蛋白酶取代胶原酶。人脐静脉内皮细胞的鉴定采用人第Ⅷ因子荧光抗体检查鉴定。动脉硬化测定仪使用

　　为确定茶色素对人血管内皮细胞作用的*佳剂量，用20、40、80、120、160mg/L不同浓度的茶色素处理人脐静脉内皮细胞，观察48小时细胞存活率，选用48小时内无毒性反应的*大剂量为*大无毒作用剂量。

　　茶色素对内皮细胞eNOS蛋白表达的影响：融合生长良好的内皮细胞，换2%胎牛血清FCS的RPMI 1640过夜，然后用5% FCS的RPMI 1640培养，并加茶色素20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml共孵育24小时。1 XSDS凝胶加样缓冲液提取蛋白质，Bradford方法测蛋白浓度。7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样40μg蛋白，转膜后加抗人eNOS抗体(1：500)，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1：400)。ECL增强发光，LEICA Q550IW图像分析系统，进行扫描定量分析。

　　茶色素对内皮细胞eNOS mRNA表达的影响：融合生长良好的内皮细胞，换2%FCS的RPMI 1640过夜，然后用5%FCS的RPMI 1640培养，并加茶色素20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml共孵育24小时。用异硫氰酸胍法抽提细胞总RNA。RNA的浓度在260nm处用分光光度计进行检测。经反转录后进行PCR反应。eNOS引物序列正义：5'-GGT CGC TTC GAC GTG CT-3';反义：5'-TCC CCA TTC CCA AAT GTG CT-3';产物长883bp。

　　为确保在每一样品中所加RNA的数量一致，用3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，306bp)作为内参对照。PCR反应条件为：预变性94℃3分钟、变性94℃45秒、退火57℃60秒、延伸72℃90秒、循环35轮，后延伸5分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色观察，LEICA Q550IW图像分析系统，进行扫描定量分析。

　　二、结果

　　①茶色素对内皮细胞的毒性：动脉硬化测定仪参考值

　　用细胞计数法和MTT法观察结果表明，在低于80mg/L浓度时，细胞存活率能维持较高水平(90%以上)，而120mg/L以上浓度时细胞存活率明显下降。因此，以20、40、80mg/L为体外试验浓度。

　　②茶色素对内皮细胞eNOS蛋白水平的影响：

　　内皮细胞在茶色素浓度分别为20、40、80mg/L的培养基中培养24小时，eNOS蛋白表达水平明显升高，分别升高1.65、2.36、3.93倍，呈明显的剂量-反应关系(r=-0.999)。见附表。

　　③茶色素对内皮细胞eNOS mRNA水平的影响：

　　内皮细胞在茶色素浓度分别为20、40、80mg/L的培养基中培养24小时，eNOS mRNA表达水平明显升高，分别升高1.89、2.20、2.27倍。

　　三、讨论

　　一氧化氮是在一氧化氮合酶作用下，由 L-精氨酸氧化形成L-胍氨酸的同时生成的。一氧化氮作为生物信使分子在维持内皮依赖性血管舒张有重要的作用。

　　高胆固醇血症的动物和人，*早出现的血管异常之一即为内皮依赖性血管舒张反应下降，这种血管反应性变化远远早于血管壁结构的变化。在饮食性实验性动脉粥样硬化中，内皮及平滑肌细胞膜脂质双分子层出现明显的重构，其中*显著的变化即为膜胆固醇含量大大增高，内皮细胞膜掺入大量胆固醇的结果造成与膜联结的内皮型一氧化氮合酶eNOS活性下调。

　　一氧化氮在动脉粥样硬化症AS形成过程中具有双重性，基础水平的NO(来源于内皮)对AS形成起抑制作用。非内皮的NO合成增加，可促进AS形成，抑制诱导型一氧化氮合酶iNOS活性则明显抑制动脉钙超负荷和动脉硬化进展，eNOS活性增强或表达增加有利于预防AS的发生。

　　本次实验应用Western Blot和RT-PCR两种方法检测了茶色素对eNOS表达的影响，结果茶色素明显诱导人脐静脉血管内皮细胞eNOS蛋白表达和mRNA表达。在体实验，茶色素明显诱导Apo E缺陷小鼠主动脉eNOS蛋白表达，与体外实验方法获得了较好的一致性，从不同的角度进一步确定了研究结果，到目前为止，尚未见到有关茶色素对eNOS表达的报道。茶色素诱导eNOS表达，可能是其抗AS机制之一。